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更新時間：2022-09-16
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文獻背景
CGAS-STING1信號通路對于介導先天性免疫中I型干擾素和其他促炎細胞因子的產生至關重要。通過胞質DNA刺激，CGAS產生內源性第二信使cGAMP，進一步激活STING1。作為一種關鍵的銜接蛋白，STING1協調信號轉導以觸發IRF3磷酸化和后續IFNs(I型干擾素)產生，以及多個ISGs(IFN刺激基因)和炎癥細胞因子的下游表達。DNA對I型IFN的誘導對防御病毒感染和抗癌免疫至關重要。然而，據報道，STING1的過度激活與自身炎癥和自身免疫性疾病有關，包括Aicardi-Goutières綜合征/AGS，嬰兒期發病的STING1相關血管病變/SAVI，以及SLE(系統性紅斑狼瘡)。因此，CGAS-STING1信號通路的活性，尤其是STING1信號通路的活性，必須經過精確而嚴格的調控，才能維持免疫穩態，以避免自身免疫性疾病的發生。已有研究表明泛素-蛋白酶體系統和自噬途徑在CGAS-STING1信號通路中起負調控的作用.大家知道，這些程序在CGAS-STING1信號激活后不久就會啟動STING1降解。然而，STING1周轉的詳細機制仍然有限。
在真核生物中，自噬是清除受損細胞器、蛋白質聚集物和入侵病原體的重要而保守的過程。這一過程需要形成雙膜結合的自噬體，隨后與溶酶體融合，導致被隔離的底物降解和回收。自噬參與多種生理和病理過程，包括癌癥、感染、炎癥、神經退行性變和免疫等。自噬系統的成分可以直接抑制刺激I型IFN產生的蛋白復合物的激活。早期研究表明，ATG9A(自噬相關的9A)負向控制ER相關STING1的轉運，并抑制TBK1(TANK binding kinase 1)的活化和下游I型IFN的產生。此外，其他研究表明，激活的STING1直接驅動自噬過程，其中TBK1磷酸化SQSTM1，使STING1降解。此外，STING1是一種潛在的自噬受體，通過其LC3相互作用區域基序直接與MAP1LC3/LC3(微管相關蛋白1輕鏈3)相互作用，介導自噬和自身自噬降解，調節先天免疫反應。另一項研究表明，STING1激活自噬，而該過程獨立于TBK1的激活和干擾素的產生。盡管先前的研究表明，STING1信號通路與自噬過程之間存在很強的相關性，但STING1信號轉導與自噬相互調節關系的詳細調控機制仍不清楚。STING1信號與自噬機制之間的串擾需要進一步研究。
UXT是一種小的伴侶蛋白，廣泛表達于大多數組織中，并在脊椎動物物種中保守。先前的研究表明，UXT在小鼠視網膜退行性疾病和斑馬魚血管生成中發揮關鍵作用。此外，還發現UXT是NFKB/NF-κB轉錄增強體中重要的輔助因子。UXT普遍存在的表達模式和不同的生物學途徑表明UXT的功能似乎是多效性的。UXT在其他生物學途徑中的作用仍有待探索。在這項研究中，作者發現UXT是STING1介導的I型IFN信號通路中一個重要的負調節因子，通過SQSTM1選擇性自噬降解STING1。該研究發現UXT通過選擇性自噬與STING1特異性地相互作用并降解，從而避免了STING1的過度激活。在機制上，UXT通過激活CGAS-STING1信號通路，促進SQSTM1和STING1的相互作用，動態增強了STING1自噬降解。通過整合幾個大型SLE白細胞和PBMC(外周血單核細胞)隊列的基因表達譜，該研究進一步表明UXT的表達顯著降低，并且與SLE患者的白細胞和PBMC中的I型IFN特征呈負相關。值得注意的是，UXT過表達導致SLE患者PBMC中I型IFNs和ISGs顯著減少，這表明UXT可能是治療自身免疫性疾病的一個新的治療靶點。該研究揭示了UXT在調節CGAS-STING1信號通路活性中的重要功能，并為STING1信號通路與自噬過程之間的串擾提供了新的見解。
基本信息
摘要
STING1是cGAS(環狀GMP-AMP合酶)-STING1信號傳導的關鍵銜接蛋白，對I型IFN產生先天免疫至關重要。然而，STING1的過度或長時間激活與自身炎癥和自身免疫疾病有關。因此，防止STING1過度激活對于維持免疫穩態很重要。在該研究中，作者報道了UXT，一種小的伴侶蛋白樣蛋白，對于通過SQSTM1(sequestosome 1)自噬降解STING1來防止STING1介導的I型IFN信號傳導的過度激活至關重要。在DNA模擬物或環狀GMP-AMP(cGAMP)刺激下，UXT與STING1特異性相互作用，并通過選擇性巨自噬/自噬促進STING1降解。而且，通過促進SQSTM1和STING1的相互作用，需要UXT來更有效地自噬降解STING1。UXT在減弱CGAS-STING1信號傳導中的體內作用在DNA病毒感染的小鼠模型和TMPD(2,6,10,14-四甲基十五烷)誘導的鼠狼瘡模型中得到進一步證實。有趣的是，UXT的表達一直受損，并且與幾個大型SLE(系統性紅斑狼瘡)隊列的白細胞和PBMC(外周血單核細胞)中的I型IFN特征呈顯著負相關。重要的是，UXT的補充有效地抑制了SLE患者PBMC中IFN和ISG的產生。總之，該研究揭示了UXT在STING1自噬降解以維持免疫穩態中的新調節作用。UXT可能是減輕自身免疫性疾病中異常I型干擾素的潛在治療靶點。
研究內容及結果
1.UXT是CGAS-STING1信號通路的一種新型調控因子
為了探索UXT在CGAS-STING1信號通路中的潛在作用，作者將靶向UXT的siRNA轉染到MEFs(小鼠胚胎纖維細胞)中，siRNA轉染實現了UXT敲除(圖1A)。然后進行RNA-seq(RNA測序)實驗，測量Uxt敲除和控制MEFs在刺激cGAMP后基因表達水平的分子變化。發現，與對照MEFs相比，敲除UXT導致大多數差異表達的ISGs明顯更多(負二項檢驗，FDR<0.05)(圖1B)，這表明UXT可能在調控CGAS-STING1信號通路中發揮作用。與此相一致的是，顯著上調的基因在先天免疫反應、免疫系統過程、細胞對干擾素-β的反應等生物學過程中強烈富集(圖1C)，這些都與CGAS-STING1信號激活相關。作者進一步通過real-time PCR驗證了IRF3響應基因，Ifna4和干擾素刺激基因(Cxcl10，Isg15，Ifit1，Rsad2)的表達變化與RNA-seq數據一致，在cGAMP處理的UXT敲除的MEFs(小鼠胚胎纖維細胞)中，Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表達顯著增加(圖1D,E)。此外，在UXT敲除的MEFs中，由鯡魚睪丸DNA(HTDNA)或干擾素刺激DNA觸發的IRF3應答基因和ISGs的表達也顯著增加(圖1F,G)。IRF3磷酸化是CGAS-STING1信號通路激活的標志。與對照MEFs相比，在UXT敲除的MEFs中，由HTDNA和cGAMP觸發的IRF3磷酸化增強(圖1H,I)。總之，這些數據表明UXT是CGAS-STING1信號通路的一種新型調控因子。
2.UXT抑制CGAS-STING1信號響應
作者研究了過表達UXT是否對CGAS-STING1信號通路有實質性影響。通過轉染UXT表達質粒，進行RNA-seq實驗，檢測UXT過表達和對照MEFs在cGAMP刺激后基因表達水平的分子變化。轉染成功實現了UXT的高效過表達(圖2A)。與UXT敲除的MEFs的結果相反，過表達UXT顯著下調了cGAMP誘導的大部分差異表達的ISGs表達(圖2B)。此外，顯著下調的基因在先天免疫反應、免疫系統過程、細胞對干擾素-β的反應等生物學過程中高度富集(圖2C)，其中大部分與UXT敲除實驗重疊。為了進一步證實這一點，作者通過real-time PCR驗證了IRF3應答基因及下游ISG基因的表達變化。在經過cGAMP處理的UXT過表達MEFs中，Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表達顯著降低(圖2D,E)。此外，過表達UXT還可以抑制HTDNA或ISD觸發的IRF3-應答基因和ISGs的表達(圖2F,G)，并減弱HTDNA和cGAMP誘導的IRF3磷酸化(圖2H,I)。綜上所述，這些數據表明UXT是CGAS-STING1信號通路的抑制劑。
3.UXT缺乏增強了CGAS-STING1體內信號響應
UXT基因缺失導致胚胎早期死亡。為了進一步證實UXT在CGAS-STING1信號通路中的作用，作者將loxP-flanked UXT純合子小鼠(UXTfl/fl)與表達Lyz2/LysM-cre的小鼠雜交，獲得骨髓細胞特異性UXT缺陷小鼠(UXTfl/flCre,UXT條件敲除[cKO])。為了檢測UXT缺失的有效性，作者通過western blot方法分析了對照組和UXT cKO BMDMs(骨髓源性巨噬細胞)上的UXT表達。在UXT cKO BMDMs中基本上沒有觀察到UXT信號(圖3A)，表明UXT在髓系細胞中被有效地敲除。然后從對照組和UXT cKO小鼠制備BMDMs，用cGAMP刺激。采用RNA-seq實驗檢測cGAMP處理對照組和UXT cKO小鼠BMDMs基因表達水平的分子變化。結果表明，大多數在用cGAMP刺激后，UXT cKO BMDMs中差異表達的ISGs相對于對照組表達上調(圖3B)。UXT cKO BMDMs中顯著上調的基因在CGAS-STING1信號通路相關的生物學過程中強烈富集，包括先天免疫反應、免疫系統過程和細胞對干擾素-β的反應(圖3C)。根據RNA-seq數據，實時PCR結果顯示，與對照BMDMs相比，cGAMP處理的UXT cKO BMDMs中Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表達顯著增加(圖3D,E)。當使用HTDNA和ISD作為刺激時，也得到了類似的結果。此外，UXT的缺失促進了HTDNA和cGAMP誘導的IRF3磷酸化(圖3F)。綜上所述，這些數據證實了UXT在CGAS-STING1信號通路負調控中發揮作用。
在DNA-病毒感染小鼠模型的基礎上，作者進一步研究了UXT的體內功能。作者給UXT cKO小鼠和對照組同窩小鼠靜脈注射HSV-1，并監測它們的存活率。UXT cKO小鼠感染HSV-1后的死亡率低于對照組(圖3G)。此外，在感染單純皰疹病毒1型(HSV-1)后，UXT cKO小鼠血清中IFNB蛋白的豐度明顯高于對照組小鼠(圖3H)。此外，UXT cKO小鼠在HSV-1感染后，清除病毒的能力增強，減少肺部炎癥細胞浸潤和組織損傷(圖3I)。UXT cKO小鼠肺和脾臟組織中Ifnb和Ifna4 mRNA的表達明顯高于對照組(圖3J)。這些結果表明UXT在體內負調控CGAS-STING1信號通路中的作用。
4.UXT在STING1水平上調控CGAS-STING1信號
為了確定UXT調控CGAS-STING1信號通路活性的分子機制，作者在HEK293細胞中過量表達UXT和CGAS、STING1、TBK1或IRF3 5D以及IFNB-熒光素酶報告基因。前期研究發現，CGAS-STING1-TBK1-IFR3軸的每個基因過表達均強烈激活CGAS-STING1信號通路，導致IFNB的誘導。因此，通過操縱UXT表達，同時過表達CGAS、STING1、TBK1或IRF3 5D，可以確定更特異的UXT調控的信號傳導事件。結果顯示，UXT可以減弱CGAS和STING1誘導的I型IFN信號，但不能減弱TBK1或IRF3 5D(圖4A)。作者只觀察到在UXT敲除細胞中CGAS和STING1介導的I型IFN信號通路顯著增加(圖4B)。在此外，UXT顯著影響cGAMP誘導的IRF3應答基因的激活(圖1D,E，圖2D,E，圖3D,E)。由于CGAS和TBK1分別在CGAS-STING1信號轉導軸中作用于STING1的上游和下游，這些數據表明，UXT在STING1水平調控CGAS-STING1信號介導的I型IFN信號。緊接著，作者驗證了UXT對STING1的調控作用。共免疫沉淀和免疫印跡分析顯示，UXT與STING1特異相關，而UXT不與CGAS、TBK1或IRF3相互作用(圖4C)。作者發現UXT和STING1之間的關聯是動態調節的。HTDNA處理后，UXT與STING1發生相互作用，而HTDNA處理前，UXT與STING1的相互作用可以忽略不計，說明在激活CGAS-STING1信號通路后，UXT與STING1特異結合(圖4D)。在cGAMP刺激后的UXT和STING1免疫沉淀實驗中也觀察到了類似的結果(圖4E)。此外，作者進行了鄰近連接實驗，以證實HTDNA刺激后UXT與STING1相互作用(圖4F)。綜上所述，這些數據證實了UXT在CGAS-STING1信號激活后與STING1相互作用。
5. UXT促進STING1的自噬降解
先前的研究報道，在CGAS-STING1信號激活后不久，STING1開始降解。作者注意到，HTDNA處理顯著降低了STING1的蛋白水平。發現UXT過表達導致HTDNA刺激后STING1的加速降解(圖5A)。當使用ISD和cGAMP作為刺激時，也觀察到了類似的結果(圖5B,C)。為了進一步驗證這些結果，作者在HTDNA刺激后測定了UXT敲除細胞中STING1的蛋白水平，發現UXT敲除抑制了STING1的降解(圖5D)。此外，UXT敲除也阻礙了在ISD和cGAMP刺激后的STING1降解(圖5E,F)。綜上所述，這些數據表明UXT促進了STING1的降解。
在真核細胞中，蛋白質降解主要依賴于兩條途徑：泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體途徑。作者進一步研究了兩條通路中哪一條可能參與了UXT介導刺激后STING1降解。研究發現，自噬抑制劑3-MA(3-甲基腺嘌呤)和自噬-溶酶體抑制劑氯喹的處理可以恢復UXT過表達的STING1蛋白豐度下調，而蛋白酶體抑制劑MG132則不能(圖5G,H)，這表明UXT促進了STING1的自噬降解。為了證實這一點，作者進一步研究了UXT對自噬潮的影響，通過測定LC3的脂化，LC3是一種特征良好的自噬指標，自噬活性增加后升高。結果顯示，在UXT敲除細胞中LC3-II顯著降低，在UXT過表達細胞中LC3-II顯著升高，說明UXT提高了自噬活性(圖5I)。此外，UXT介導的IFN信號抑制在自噬抑制細胞中也被*消除(圖5J)。綜上所述，這些結果表明UXT促進了STING1的自噬降解，從而進一步抑制STING1介導的I型IFN信號通路。
6.UXT促進了SQSTM1和STING1的互作
作者繼續探索UXT如何調控STING1自噬降解。已知有四種自噬受體可選擇性靶向自噬降解蛋白：SQSTM1、NBR1、CALCOCO2/NDP52和OPTN(opti-neurin)。為了確定UXT介導的STING1自噬降解是由哪一種受體參與的，作者通過免疫沉淀和免疫印跡檢測UXT與這4種自噬受體的相互作用。研究發現，UXT與SQSTM1特異相關，而未觀察到UXT與其他三種自噬受體之間的相互作用(圖6A-D)。為了檢驗這些發現的生理相關性，作者用HTDNA刺激細胞，發現在DNA模擬刺激后，UXT與SQSTM1強相關(圖6E)。此外，在cGAMP刺激后，UXT也與SQSTM1相關(圖6F)。總之，這些數據表明UXT在CGAS-STING1信號激活過程中與SQSTM1相互作用。此前有研究報道SQSTM1與STING1相互作用并介導STING1自噬降解。作者發現，在cGAMP刺激下，通過免疫沉淀和免疫印跡分析，SQSTM1與STING1相互作用。并發現UXT在HTDNA刺激后與SQSTM1和STING1同時相互作用(圖6G)。此外，作者還發現，與對照組相比，UXT敲除細胞在HTDNA刺激后，SQSTM1和STING1的相互作用顯著降低圖6H)。當使用cGAMP作為刺激時也得到了類似的結果(圖6I)。相反，在HTDNA或cGAMP刺激后，與對照細胞相比，在UXT過表達細胞中SQSTM1和STING1的相互作用顯著增強(圖6J,S4C)。為了進一步確定UXT與SQSTM1和STING1相互作用的結構域，作者利用一系列UXT的缺失突變體，發現UXT與SQSTM1-STING1相互作用需要UXT的N末端區域。綜上所述，這些數據表明，UXT促進了SQSTM1和STING1的相互作用，從而促進了STING1的自噬降解。
7.UXT可緩解SLE患者的I型干擾素異常
SLE是一種常見的自身免疫性疾病，其特點是I型IFNs和ISGs的異常誘導。考慮到UXT在調節STING1介導的I型IFN信號通路中的重要作用，作者研究了UXT在SLE患者中是否失調。作者對1211名SLE患者和139名健康者的4個大規模白細胞和PBMCs細胞基因表達譜進行了整合分析。發現在所有四個獨立的SLE組中，UXT的表達均顯著受損(圖7A, Wilcoxon 秩和檢驗，p<10e?5)。UXT在SLE患者的T細胞、B細胞和單核細胞中均有下調，且沒有明顯的細胞型特異性(圖7B)。UXT的表達表現出與I型IFN信號強負相關，I型IFN信號是通過21個成熟的ISGs(也稱為21個IFNG信號)測量的。在所有四個SLE組中，幾乎所有的比較中，UXT與這21個ISG基因的表達均呈顯著的負相關(圖7C,皮爾遜相關，FDR<0.05)，并且UXT與21個ISG基因的整體表達相關性顯著低于作為背景的四個SLE組(圖7D,Wilcoxon 秩和檢驗，p<10e?10)。基于這些觀察結果，作者研究了UXT表達是否可以調控SLE患者的I型IFN信號。從SLE患者的血液樣本中分離PBMCs，并通過電穿孔轉染空載體(Vec)或UXT表達質粒(UXT)。轉染UXT表達質粒或其對照質粒48 h后，UXT處理的SLE患者外周血單核細胞中UXT mRNA水平明顯高于Vec處理的SLE患者外周血單核細胞中UXT mRNA水平(圖7E)。在UXT處理的SLE患者PBMCs,IFNB和ISGs(CXCL10,ISG15,ISG54,ISG56)mRNA水平顯著降低(圖7F-J)，表明UXT減弱了SLE患者PBMCs中的I型IFN信號應答。綜上所述，這些數據表明UXT可能是緩解SLE患者外周血單核細胞中異常I型IFNs的抑制因子。
作者進一步研究了UXT在TMPD誘導的小鼠狼瘡模型中的作用，與對照組小鼠相比，UXT cKO小鼠TMPD誘導的ISGs如Ifit1、Ifit3、Rsad2、Isg15和Gbp6表達明顯增加，這與UXT對ISGs表達的負調控作用一致。狼瘡腎炎是SLE的病理特征之一，其特點是腎小球免疫復合物沉積和尿素氮和肌酐蓄積。作者觀察到，在TMPD治療后，UXT cKO小鼠的肌酐和尿素氮水平明顯高于對照組小鼠。此外，與對照組小鼠相比，UXT cKO小鼠腎小球IgG沉積也有所升高。總之，這些數據表明，UXT缺乏導致了ISGs的表達增加，并在TMPD誘導的小鼠狼瘡模型中加劇了實驗性狼瘡腎炎。
結論
作者發現UXT是STING1介導的I型IFN信號通路的重要負調控因子。在機制上，UXT特異性地與STING1相互作用，并在DNA模擬或cGAMP刺激后通過選擇性自噬增強STING1降解。UXT通過促進SQSTM1和STING1的相互作用促進了STING1的自噬降解。病理上，UXT在SLE患者白細胞和PBMCs中表達受損，UXT的補充抑制了SLE患者PBMCs中I型IFNs和ISGs的產生。另一方面，作者通過對四組SLE患者的多個大規模基因表達譜的整合分析，發現STING1的負調控因子UXT在SLE患者的白細胞和PBMCs中顯著下調。此外，UXT和I型IFN在SLE中顯著負相關。因此，需要注意的是，UXT的過表達顯著降低了SLE患者PBMCs中I型IFNs和ISGs的產生。雖然SLE是一種異質性疾病，但作者發現在四組獨立的SLE患者中，UXT均持續受損。UXT有望成為治療SLE患者I型干擾素活性異常的潛在靶點。
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