文獻背景

基本信息

摘要

研究內容及結果

1.FAPα在貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型被劫持竇狀毛細血管的HSC中的表達

2.FAPα誘導HSC分泌CXCL5以促進血管劫持

將具有貝伐單抗固有耐藥性的MC38小鼠結腸腺癌細胞系直接注射到Fap野生型小鼠（Fapfl/fl）或HSC特異性條件Fap敲除小鼠（FapΔGfap）的肝實質，以生成固有貝伐單抗耐藥的CRCLM同種移植物（圖2A）。

結果表明，與Fapfl/fl小鼠相比，FapΔGfap小鼠的被劫持竇狀毛細血管顯著減少（圖2，B和C）。作者推測FAPα⁺HSC可能預先建立免疫抑制微環境并誘導腫瘤細胞EMT促進血管劫持。與推測相符，Gr-1⁺MDSCs的募集被顯著抑制（圖2D），CD8⁺T細胞的出現顯著增加（圖2E），間充質標記物波形蛋白和N-神經鈣粘附蛋白的表達降低，上皮標記物E-鈣黏蛋白的表達增加（圖2F）。

  為了進一步研究FAPα在HSC調控的血管劫持中的機制，作者生成了FAPα穩定過表達的人肝星狀細胞系LX-2和陰性對照細胞（LX-2^Vector）。結果表明，FAPα穩定過表達可提高編碼分泌因子CSF2、IL18、CXCL5、IL33、IL1B和IL16的基因水平（圖3A），CXCL5是很顯著的上調基因（圖3B）。ELISA檢測表明，LX-2^FAP細胞培養上清液中的CXCL5水平明顯高于LX-2^Vector細胞（圖3C）。

鑒于腫瘤來源的CXCL5通過激活CXCR2促進腫瘤細胞EMT和MDSC募集，作者提出HSC來源的FAPα通過CXCL5-CXCR2軸促進腫瘤細胞的EMT和MDSC招募。作者發現，LX-2^FAP細胞的條件化培養基可刺激MDSCs和HCT116細胞內Ca²⁺動員的快速和短暫增加，增強了MDSC的遷移，促進了HCT116細胞的遷移和侵襲，增加了波形蛋白、N-鈣粘蛋白和snail的表達，并降低了HCT116細胞中E-鈣粘蛋白的表達（圖3，E-G）。CXCL5中和抗體或SB225002（CXCR2抑制劑）可顯著減弱這些效應（圖3，D-G）。證實了FAPα誘導HSC分泌CXCL5，通過激活CXCR2促進腫瘤細胞EMT和MDSC的招募，從而促進血管的劫持作用。

3.腫瘤細胞來源的FGFBP1誘導HSC中FAPα的表達以促進血管劫持

蛋白質組學分析表明，在貝伐單抗耐藥腫瘤中發現了17種上調蛋白（圖4A）。FGFBP1水平為很顯著的上調基因，且表達量顯著高于空白組（圖4，B-D）。

在FGFBP1低表達HCT116細胞上建立FGFBP1過表達細胞系，在FGFBP1高表達HT-29細胞上建立FGFBP1抑制細胞系。結果表明，FGFBP1過表達可提高RHGP比率，而FGFBP1抑制表達可降低RHGP比率（圖4E）。同樣的，FGFBP1過表達組中被劫持竇狀毛細血管的數量及HSCs中FAPα的表達均顯著高于FGFBP1抑制組（圖4F和G）。此外，FGFBP1過表達組中的MDSC的募集和腫瘤細胞EMT也更顯著。綜上所述，表明腫瘤細胞來源的FGFBP1誘導HSC中FAPα的表達并促進血管劫持。

4.腫瘤細胞來源的FGFBP1通過FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1軸誘導HSC中FAPα的表達

FGFBP1可以通過從細胞外基質（ECM）釋放FGF2來增強FGFR1信號的激活。作者提出HSC中FGFR1激活誘導的FAPα的表達可能受ERK1/2-GGR1軸調控。結果表明，使用FGFBP1過表達細胞的條件培養基處理的LX-2細胞中FGFR1和ERK1/2的磷酸化以及EGR1和FAPα的表達顯著增加（圖5A）。FGF2和FGFR1的抑制可顯著減弱上述作用（圖5，A和B）。此外，LY3214996（ERK1/2特異性抑制劑）治療顯著抑制了EGR1和FAPα的表達（圖5C），而抑制EGR1顯著降低了FAPα的表達（圖5D）。

體內實驗還表明，FGF2中和抗體或PD-166866（FGFR1特異性抑制劑）顯著抑制FGFBP1過表達CRCLM異種移植物HSC中p-FGFR1、p-ERK1/2、EGR1和FAPα的表達（圖5G和補充圖8A）。這些數據表明，腫瘤細胞來源的FGFBP1通過FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1軸誘導HSC中FAPα的表達。

5.貝伐單抗通過激活HSC中的FGF2-FGFR1-FAPα-CXCL5軸誘導血管劫持

貝伐單抗與FGF2中和抗體或PD-166866的聯合應用顯著抑制了貝伐單抗耐藥HCT116和HT-29CRCLM異種移植物的腫瘤生長，并降低了MVD。同時也顯著降低了RHGP的比率（圖6A和補充圖10A）和被劫持竇狀毛細血管的數量（圖6B和補充圖10 B）。FGF2中和抗體和PD-166866均抑制HSC中p-FGFR1和FAPα的表達水平（圖6C和補充圖10C），抑制Gr-1⁺MDSC的募集（圖6D和補充圖10D），降低波形蛋白的表達，并增加腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白的表達（補充圖10E）。這些數據表明，貝伐單抗通過激活FGFR1-FAPα軸促進腫瘤細胞EMT和MDSC募集而誘導血管劫持作用。

ELISA分析表明，FGFR1的抑制可顯著降低CXCL5的表達（圖6E），并且抑制了MDSC的遷移和HCT116細胞的遷移和侵襲（圖6、F和G以及補充圖11B），降低了波形蛋白、N-鈣粘蛋白和snail的表達，增加了HCT116中E-鈣粘蛋白的表達（圖6H和補充圖11C）。然而，FAPα的過度表達完整挽救了這些抑制作用（圖6E-H）。這些發現表明，FGFR1激活可能依賴于FAPα誘導HSC分泌CXCL5，促進腫瘤細胞EMT和MDSC募集，從而促進血管劫持。

6.貝伐單抗誘導的HSC中FAPα表達與CRCLM患者的血管劫持作用相關

如CRCLM患者的CT掃描所示（圖7A），術前化療聯合貝伐單抗（Chemo+Bev）組治療的患者DHGP或PHGP的病灶形態顯著轉化為RHGP，但單用化療（Chemo）組的病灶形態不明顯。組織病理學檢查顯示，DHGP和PHGP主要存在于Chemo的患者中，而Chemo+Bev治療的患者主要含有RHGP（圖7B）。

Chemo+Bev治療的患者腫瘤中FGFBP1的表達比Chemo治療的患者更強（圖7C）。Chemo+Bev治療患者被劫持竇狀毛細血管和FAPα⁺HSC的數量增多（圖7D），并且顯示出更高的p-FGFR1水平（圖7E）。此外，在CRCLM患者中，FAPα⁺HSC的數量與FGFBP1表達、被劫持竇狀毛細血管或RHGP呈正相關（圖7F）。患有RHGP的CRCLM患者對貝伐單抗的反應較差，這可以從接受Chemo+Bev治療的患者的腫瘤負荷增加（與接受Chemo治療的患者相似）得到證明（圖7G）。綜上所述，這些數據表明貝伐單抗治療導致FGFBP1-FGFR1-FAPα軸激活，這可能是血管劫持介導貝伐單抗耐藥性的原因。

7.以FAPα⁺HSC為靶點破壞被劫持的竇狀毛細血管以克服貝伐單抗耐藥性

接下來，作者研究了利用Z-GP-DAVLBH（作者實驗室合成的一種FAPα激活前體藥物）在被劫持竇狀毛細血管中以FAPα⁺HSC為靶點是否可以消除貝伐單抗誘導的血管劫持。結果表明，Z-GP-DAVLBH治療在貝伐單抗耐藥的HCT116和HT-29CRCLM異種移植物中均誘導腫瘤消退，如增加壞死面積（圖8，A和B）和腫瘤組織中MVD減少（補充圖12A）。

從機制上講，Z-GP-DAVLBH治療逆轉了RHGP的發展（圖8，A和B），減少了被劫持竇狀毛細血管的數量（圖8C），阻止了Gr-1⁺MDSC的募集，抑制了腫瘤細胞EMT。此外，還破壞了被劫持竇狀毛細血管，導致肝臟腫瘤界面出血（補充圖12E）。這種效應可能與Z-GP-DAVLBH誘導的被劫持竇狀毛細血管中FAPα⁺HSC細胞凋亡有關（圖8D）。最終，Z-GP-DAVLBH延長了HT-29和HCT116CRCLM異種移植小鼠的總存活時間（圖8E）。這些數據表明，Z-GP-DAVLBH選擇性誘導FAPα⁺HSC凋亡，破壞被劫持竇狀毛細血管，并克服血管劫持介導的貝伐單抗治療耐藥性。

結論