細(xì)胞凋亡檢測

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主流方法+攻略詳解+實驗好物

細(xì)胞凋亡作為程序性死亡的核心形式，在發(fā)育調(diào)控、疾病機(jī)制(如癌癥、免疫缺陷)及藥物研發(fā)中具有重要研究價值。細(xì)胞凋亡的主要形態(tài)學(xué)特征包括：染色質(zhì)固縮、DNA片段化、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞皺縮、凋亡小體的形成等。

針對其復(fù)雜動態(tài)過程，我們該如何檢測細(xì)胞凋亡？不同實驗場景該選哪種方法？如何避免選型誤區(qū)？如何提升檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性？本文系統(tǒng)梳理細(xì)胞凋亡檢測的核心方法，對比各方法的優(yōu)劣勢與適用場景，幫您高效完成實驗。

目前至少有數(shù)十種檢測細(xì)胞凋亡的方法，可以大致劃分為基于細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標(biāo)記三大類。

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基于生物學(xué)功能的方法

1.1 線粒體膜電位的檢測

凋亡早期細(xì)胞，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位 (ΔΨm) 下降甚至消失。線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的生物學(xué)變化。一旦線粒體膜電位被破壞，細(xì)胞凋亡將不可逆轉(zhuǎn)。目前常用一些親脂性陽離子染料如JC-10、JC-1檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位較高時，JC-1在基質(zhì)中匯聚形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光 (Ex/Em=585/590 nm)；線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，以單體形式存在產(chǎn)生綠色熒光 (Ex/Em=515/529 nm)。

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1.2 細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS)位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)；細(xì)胞凋亡早期，PS會外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。Annexin V (膜聯(lián)蛋白 V)是一種 Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與 PS 特異性結(jié)合，因此 Annexin V常作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。Annexin V經(jīng)FITC標(biāo)記后可發(fā)綠色熒光。碘化丙啶 (PI)染色液是一種不能穿透細(xì)胞膜的紅色熒光染料，可對凋亡晚期細(xì)胞及壞死細(xì)胞染色。經(jīng) Annexin V-FITC和PI聯(lián)合染色后，正常細(xì)胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)，機(jī)械性損傷的細(xì)胞呈紅色熒光（Annexin V-/PI+）。

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1.3 線粒體膜轉(zhuǎn)換孔檢測

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，線粒體膜電位轉(zhuǎn)換孔滲透性發(fā)生改變，Ca²⁺的過載，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細(xì)胞色素C的釋放，線粒體膜電位下降等都會導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的激活。

1.4 細(xì)胞凋亡的Ca²⁺濃度變化測定

細(xì)胞的生命活動都離不開 Ca²⁺，Ca²⁺超載時，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，細(xì)胞內(nèi)外Ca²⁺平衡被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。用 Ca²⁺特異性熒光探針，如Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8等對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，再用FCM或熒光、共聚焦顯微鏡檢測，可以準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞凋亡。

02

基于生化標(biāo)記的方法

2.1 凋亡分子標(biāo)記檢測

Caspase蛋白家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中具有重要的作用。絕大多數(shù)情況下，所有的凋亡信號都會匯集到凋亡的最終執(zhí)行者Caspase-3上。在正常細(xì)胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期Caspase-3被激活，并執(zhí)行最后的凋亡程序。因此可以通過檢測Caspase 3剪切體的含量或Caspase 3的活性來反應(yīng)細(xì)胞凋亡過程。

2.2 DNA片段原位檢測 (TUNEL法)

細(xì)胞凋亡時，相關(guān)DNA內(nèi)切酶被激活，進(jìn)而切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生 180-200 bp的DNA ladder，暴露的3’-OH在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特異熒光探針或生物素標(biāo)記的dUTP，借助熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或者顯色法即可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。正常或增殖細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，故很少被染色。

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基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的方法

細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，染色質(zhì)發(fā)生固縮，故經(jīng)PI、Hoechst系列等熒光染料染色后可快速檢測細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞Hoechst 33342染色觀察到強(qiáng)藍(lán)色熒光，核碎裂和核凝結(jié)。主要有熒光染料雙染和細(xì)胞核單染檢測法。

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